تاثیر لپتین بر بلوغ آزمایشگاهی و آپوپتوز اووسیت بعد از انجماد بلوری و کیفیت منی تازه و منجمد یخ گشایی شده گاومیش رودخانه ای

هورمون لپتین پروتئین 167 اسید آمینه ایست که ثابت شده است بر تولید مثل پستانداران اثر مسقیم دارد. بنابراین هدف این مطالعه ارزیابی اثرات اضافه کردن غلظت های مختلف لپتین به رقیق کننده ی منی و محیط کشت آزمایشگاهی بلوغ (ivm) اووسیت بر کیفیت اسپرم (تحرک و پارامتر های تحرک، زنده مانی و آسیب به dna) و درصد بلوغ و آپوپتوز اووسیت در گاومیش های رودخانه ای بود. از پنج گاومیش نر سالم (پنج انزال از هر حیوان) موجود در مرکز اصلاح نژاد و پرورش گاومیش شمالغرب کشور استفاده شد. هر انزال در 37 درجه سانتی گراد در رقیق کننده ی تریس (به نسبت 1 به 10) حاوی 0 (کنترل)، 10، 20، 50، 100 و 200 ng/ml لپتین رقیق شدند. منی رقیق شده جهت رسیدن به تعادل در یخچال نگهداری و سپس در نی های فرانسوی 5/0 میلی لیتری ذخیره و در نهایت در نیتروژن مایع منجمد شد. جهت یخ گشایی منی، نی ها در بن ماری تنظیم شده در 37 درجه سانتی گراد به مدت 40 ثانیه قرار داده شدند. نمونه های منی بلافاصله بعد از اضافه کردن لپتین، در زمان تعادل و بعد از یخ گشایی بررسی شدند. جهت تهیه محیط ivm اووسیت های گاومیش 40 میکرولیتر از محلول سدیم پیرووات و 2 میلی لیتر از fbs را به 6/17 میلی لیتر محیط tcm199 اضافه شد. 500 میکرولیتر از محلول فوق برداشته و با هورمون های fsh، lh، و تیمار (غلظت های مختلف لپتین که شامل 0، 10، 50 و 100 ng/ml) جهت انجام ivm مخلوط شد. تخمدان ها را از کشتارگاه صنعتی ارومیه بلافاصله بعد از کشتار گاومیش ها جمع آوری کرده و در فلاسک خلاء حاوی نرمال سالین که در دمای 37 درجه سانتی گراد تنظیم شده و حاوی iu/ml 1000 پنی سیلین و mg/ml 1 استرپتو مایسین بود قرار داده و طی حداکثر 2 ساعت به آزمایشگاه انتقال داده می شدند. مایع فولیکولی فولیکول های حفره دار کوچک به قطر 6 – 2 میلی متر توسط سرنگ استریل10 سی سی با سر سوزن با قطر شماره 18 آسپیره شد. اووسیت های با کیفیت مناسب جهت بلوغ آزمایشگاهی اووسیت ها انتخاب شدند و مجموع? اووسیت سلول کومولوس به مدت 30 – 28 ساعت (متوسط 5 اووسیت در قطره های 50 میکرولیتری) زیر روغن معدنی در دمای 5/38 درجه سانتی گراد و رطوبت 95% به همراه 5% co2 در محیط ivm کشت داده می شدند. جهت بررسی آپوپتوز اووسیت ها از کیت تشخیص آپوپتوز annexin-v-pi استفاده شد. نتایج یافته های ما نشان داد که در منی تازه بلافاصله بعد از اضافه کردن لپتین تفاوت معنی داری در هیچ یک از پارامترهای منی مورد ارزیابی ایجاد نشد. در منی متعادل شده، اضافه کردن ng/ml 10 لپتین به رقیق کننده به طور معنی داری باعث حفظ تحرک و پارامترهای تحرک و زنده مانی اسپرم نسبت به گروه کنترل شد. با این وجود، اضافه کردن ng/ml 200 لپتین، به طور معنی داری این پارامترها را کاهش داد. در منی یخ گشایی شده تمامی غلظت های لپتین تحرک و زنده مانی اسپرم را کاهش دادند که این کاهش در غلظت های 100 و 200 ng/ml معنی دار بود. اضافه کردن لپتین به رقیق کننده ی منی هیچ تاثیر معنی داری بر آسیب dna اسپرم در تمامی گروه های مورد آزمایش نداشت. در گروه های تیمار با 0 (کنترل)، 10، 50 و 100 ng/ml لپتین، درصد بلوغ اووسیت های تازه به ترتیب 65/74، 81/83، 85/77 و 40/75؛ و در اووسیت های یخ گشایی شده 23/51، 21/58، 22/54 و 84/52 بود. درصد آپوپتوز در اووسیت های تازه به ترتیب 83/9، 54/9، 93/9 و 42/10؛ و درصد آپوپتوز اووسیت های یخ گشایی شده 66/16، 27/15، 38/15 و 80/15 بود. نتایج ما نشان داد که اضافه کردن ng/ml 10 لپتین می تواند بلوغ اووسیت های تازه و یخ گشایی شده را در شرایط آزمایشگاهی بهبود بخشد ولی تاثیری بر درصد آپوپتوز اووسیت ها ندارد. در نتیجه، یافته های ما پیشنهاد می کند که اضافه کردن ng/ml 10 لپتین به رقیق کننده ی منی می تواند سبب حفظ تحرک و زنده مانی اسپرم های منی متعادل شده نسبت به گروه کنترل شود و همچنین می تواند بلوغ اووسیت های تازه و یخ گشایی شده را در شرایط آزمایشگاه بهبود بخشد.